ICS 67.120.01 CCS B 45 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 2833—2022 狼源性成分检测 实时荧光 PCR法 Real-time PCR method for detection of canis lupus -derived materials 2022-12-08发布 2023-01-08实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2833 —2022 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国二连海关。 本文件主要起草人：王伊琴、陈少博、包勇敢、杨帆、荆文魁、苏日娜、张志峰、常鸿、寇福军、 赵治国。 DB15/T 2833 —2022 1 狼源性成分检测 实时荧光 PCR法 1 范围 本文件规定了动物源性产品中狼源性成分实时荧光 PCR检测方法。 本文件适用于动物源性产品 （肉制品、 皮毛制品、 饲料等） 中狼源性成分的鉴定， 灵敏度为 0.15ng/L。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 实时荧光 PCR real -time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团 , 利用荧光信号的积累实时监控整个 PCR扩增过程。 Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵 (cetyl trithyl ammonium bromide) DNA:脱氧核糖核酸（ deoxyribonuleic acid ） EDTA：乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid) FAM:6-羧基荧光素 (6-carboxyfluorescein) PCR:聚合酶链式反应（ polymerase chain reacti on） TAMRA: 羧基四甲基罗丹明 (carboxy -tetramethyl -rhodamine) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷 [tris(hydroxymethyl)aminomethane] 5 试剂与材料 DB15/T 2833 —2022 2 水：符合 GB/T 6682 的要求。 引物对序列 : a) 上游：5′-CCGTACTCTAGCTTACATA -3′； b) 下游：5′-GAGACCTTCCAGATGAAA -3′； c) 探针序列： 5′-(FAM)- TACCTCACATTAGCCAAGAAGCCA -(TAMRA)-3′。 DNA提取试剂盒。 CTAB。 Tris-HCl (pH 8.0 ) 。 NaCl。 EDTA。 蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL) 。 三氯甲烷。 异丙醇。 75%乙醇。 实时荧光 PCR预混液。 阳性对照样品：采用已知含有狼源性成分样品的 DNA，或经测序确认的阳性质粒。 见附录B。 阴性对照样品：采用已知不含有狼（包括其他犬科动物）源性成分样品的 DNA。 空白对照： ddH2O。 6 仪器与设备 实时荧光 PCR仪（加热速率 10 ℃/s以上）。 高速台式离心机（最高转速 12000 rpm ）。 旋涡振荡器（最高转速 3000 rpm ）。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 恒温水浴锅。 天平（感量 0.01 g）。 单孔道微量移液器： 0.5 L～10 L、10 L～100 L、20 L～200 L、100 L～1000 L。 7 实验方法 DNA提取 参照附录 A中提取样品 DNA的方法提取 DNA，也可采用等效商品化的组织基因组 DNA提取试剂盒进行。 当DNA浓度吸光度值 A260 /A280在1.7～1.9之间时， 适宜于 PCR扩增。 设置至少两个平行样品且 需设立阴性、 阳性及空白提取对照。 实时荧光 PCR检测 7.2.1 反应体系 反应体系体积为 25.0 L，见表1。 DB15/T 2833 —2022 3 表1 狼源性成分实时荧光 PCR检测方法的反应体系 试剂名称 贮备液浓度 mol/L 反应体系体积 L PCR反应预混合液 — 12.5 上游引物（ F） 10.0 1.0 下游引物（ R） 10.0 1.0 探针（P） 10.0 1.0 模板 — 2.0 ddH2O — 补足至总体积为 25.0 检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。 7.2.2 反应条件 预变性： 94 ℃，3 min；变性： 94 ℃，10 s；延伸退火： 60 ℃，10 s，35个循环。在 60 ℃时收 集荧光信号值。 8 结果判定与表述 质量控制 质控对照应满足以下条件，否则应重新实验： a) 空白对照：无荧光对数增长，相应的 Ct值大于等于 35.0； b) 阴性对照：无荧光对数增长，相应的 Ct值大于等于 35.0； c) 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct值小于等于 28.0。 结果判定 8.2.1 质控对照成立条件下， 2个平行样检测结果 Ct值大于28.0，可判定被检样品为阴性。 8.2.2 质控对照成立条件下， 2个平行样检测结果 Ct值小于等于 28.0，可判定被检样品为阳性。 8.2.3 质控对照成立条件下，至少 1个平行样检测结果 Ct值28.0～35.0，并出现典型的扩增曲线， 此时应适当增加 DNA模板量重做实时荧光 PCR检测。再次检测结果仍然 Ct值小于等于 28.0，并出现典 型的扩增曲线，可判定被检样品为阳性；再次检 测结果Ct值大于28.0，可判定被检样品为阴性。 结果表述 8.3.1 结果为阳性者，表述为“检出狼源性成分”。 8.3.2 结果为阴性者，表述为“未检出狼源性成分”。 9 防止交叉污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403 中的规定执行。 DB15/T 2833 —2022 4 A A 附录 A （资料性） 溶液配制及提取方法 A.1 CTAB-提取缓冲液 将5 g CTAB ，20.45 g NaCl ，3.03 g Tris ，1.86 g Na 2-EDTA溶于200 mL水中，用盐酸调 pH 8.0 后，定容至 250 mL，115 ℃高压15 min。 A.2 CTAB-沉淀液 称0.2 g CTAB,0.234 g NaCl ，定容至 100 mL，115 ℃高压15 min。 A.3 1.2 mol/L NaCl 溶液： 称取28 g NaCl ，定容至 400 mL，115 ℃高压15 min。 A.4 DNA提取方法： A.4.1 称取样品 0.5 g～1 g加入1.5 mL～3.5 mL CTAB 提取液中，再加入 12 L～20 L蛋白酶K（根据 CTAB量调节） ，每个样品提取 2管，同时用水做空白提取对照。混匀后 65 ℃至少1 h(过夜孵育最好 )，如 样品膨胀，则可再多加 CTAB,每次多1 mL，最多10 mL。 A.4.2 4000 rpm/min ～5000 r/min 离心10 min。 A.4.3 将上清（约 1 mL）加入无菌 EP中（2 mL管） ，加入 700 L氯仿，涡旋 30 s后，再12000 rpm 离心 10 min。 A.4.4 取上清600 L～650 L加入无菌 EP管中，加入 2倍体积的 CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置 1 min。 A.4.5 12000 rpm 离心10 min，去上清。沉淀溶解于 350 L的1.2 mol/L NaCl 溶液。 （2管合并共用 350 L溶液） 。 A.4.6 加入350 L氯仿，涡旋 30 min， 12000 rpm 离心10 min。 A.4.7 取上清液至无菌 EP管中（确定体积） ，加入 0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少 20 m in，12000 rpm 离心10 min，去上清，沉淀用 500 L 75%的乙醇洗涤，再 12000 rpm 离心10 min。 A.4.8 去上清后，干燥沉淀， 60 ℃下15 s～20 s（开盖倒立） 。 A.4.9 将沉淀溶于 100 L灭菌水或 TE buffer 或DEPC水中。