ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 2835—2022 马驽巴贝斯虫检测 PCR法 PCR method for detection of babesiosis caballi 2022-12-08发布 2023-01-08实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2835 —2022 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国二连海关、内蒙古自治区市场监督管理评审查验中心。 本文件主要起草人：陈少博、杨帆、王伊琴、常鸿、包勇敢、荆文魁、腾克、赵治国。 DB15/T 2835 —2022 1 马驽巴贝斯虫检测 PCR法 1 范围 本文件规定了马驽巴贝斯虫 PCR法和实时荧光 PCR检测方法 。 本文件适用于马属动物马驽巴贝斯虫病的 分子生物学诊断 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 马驽巴贝斯虫 babesiosis caballi 马驽巴贝斯虫是引起马驽巴贝斯虫病的病原体，是一种寄生于马、驴、骡、斑马等 马属动物红细胞 内的血液原虫。 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction ；PCR 用于扩增位于已知序列之间 DNA（deoxyribonucleic acid ，脱氧核糖核酸）的方法。模板 DNA经过 高温变性成单链，在 DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分别于模板 DNA两 条链上的一段互补序列发生退火，接着在 DNA聚合酶的催化下以 4种dNTP（deoxyribo nucleoside triphosphate ，脱氧核苷酸三磷酸）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和 DNA合成这 一循环， 使位于两段已知序列之间的 DNA片段呈几何倍数扩增， 经 25～30个扩增循环， 扩增倍数达到 106。 实时荧光 PCR real -time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团 , 利用荧光信号的积累实时监控整个 PCR扩增过程。 Ct值 cycle threshold DB15/T 2835 —2022 2 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp: 碱基对(base pair) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵 (cetyl trithyl ammonium bromide) DNA:脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） EDTA：乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid) FAM:6-羧基荧光素 (6-carboxyfluorescein) PCR:聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ） TAMRA: 羧基四甲基罗丹明 (carboxy -tetramethyl -rhodamine) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷 [tris(hydroxymethyl)aminomethane] 5 试剂与材料 水：符合 GB/T 6682 的要求。 DNA提取试剂盒。 CTAB。 Tris-HCl (pH 8.0 )。 NaCl。 EDTA。 蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL) 。 三氯甲烷。 异丙醇。 75%乙醇。 Taq酶。 dNTP（2.5 mmol/L）。 PCR buffer 。 DNA分子量标准（ DNA Marker ）（50 bp～500 bp）。 实时荧光 PCR预混液。 阳性对照样品：采用已知含有马驽巴贝斯虫的 DNA，或经测序确认的阳性质粒。见 附录B。 阴性对照样品：采用已知不含有马驽巴贝斯虫的 DNA。 空白对照： ddH2O。 引物及探针 : 见表1。 DB15/T 2835 —2022 3 表1 马驽巴贝斯虫检测引物及探针 6 仪器与设备 PCR仪。 凝胶成像仪。 实时荧光 PCR仪。 高速台式离心机（最高转速 12000 rpm ）。 旋涡振荡器（最高转速 3000 rpm ）。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 恒温水浴锅。 天平（感量 0.01 g）。 单孔道微量移液器： 0.5 L～10 L、10 L～100 L、20 L～200 L、100 L～1000 L。 7 样品采集 使用添加 EDTA抗凝剂的采样管无菌采集血样。 8 检测方法 PCR法 8.1.1 样品的总 DNA提取 参照附录 A中提取样品 DNA的方法提取 DNA，也可采用等效商品化的血液 DNA提取试剂盒进行。 当DNA 浓度吸光度值 A260 /A280在1.7～1.9之间时，适宜于 PCR扩增。设置至少两个平行样品且 需设立阴性、阳性 及空白提取对照。 8.1.2 PCR扩增 反应体系为 50 L，体系组成见表 2。 检测方法 引物/探针 序列（5’-3’） 扩增片段 PCR法 上游引物 （F） 5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC -3′ 200bp 下游引物 （R） 5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG -3′ 实时荧光 PCR法 上游引物 （F） 5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC -3′ 200bp 下游引物 （R） 5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG -3′ 探针（P） 5′-（FAM）-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG -（TAMRA）-3′ DB15/T 2835 —2022 4 表2 PCR扩增反应体系组成 试剂名称 贮备液浓度 反应体系体积 L 10×Buffer(含Mg2+) － 5 Taq酶 5 U/L 0.25 dNTP 2.5 mmol/L 5 上游引物（ F） 10 mol/L 2 下游引物（ R） 10 mol/L 2 模板 － 2 ddH2O － 补足至50 检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。 8.1.3 PCR反应条件 预变性： 95 ℃，3 min；变性： 95 ℃，30 s；延伸退火： 58 ℃，1 min，35个循环； 72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存。 8.1.4 PCR扩增产物电泳检测 用TBE电泳缓冲液配制成 1.5%琼脂凝胶。将琼脂凝胶放入电泳槽中，加入 1×TBE电泳缓冲液，使液 面刚刚没过凝胶。将 5 L～8 L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合点样。 9 V/cm恒压电泳，直 至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。利用凝胶成像系统观察电泳结果并记录。 8.1.5 结果判定与表述 8.1.5.1 质量控制 质控对照应满足以下条件，否则应重新实验： a) 阳性对照 : 出现200 bp的特异性条带； b) 阴性对照：不出现 200 bp的特异性条带； c) 空白对照：不出现 200 bp的特异性条带。 8.1.5.2 结果判定 8.1.5.2.1 质控对照成立条件下，两个平行样品均出现 200 bp的特异性条带为阳性。 8.1.5.2.2 质控对照成立条件下，两个平行样品均不出现 200 bp的特异性条带为阴性。 8.1.5.3 结果表述 8.1.5.3.1 PCR产物为阳性者，表述为“检出马驽巴贝斯虫”。 8.1.5.3.2 PCR产物为阴性者，表述为“未检出马驽巴贝斯虫”。 实时荧光 PCR检测 8.2.1 样品的总 DNA提取 同7.1.1操作。 8.2.2 荧光定量 PCR扩增 DB15/T 2835 —2022 5 反应体系体积为 25 L，见表3。 表3 荧光定量 PCR扩增反应体系组成 试剂名称 贮备液浓度 mol/L 反应体系体积 L PCR反应预混合液 — 12.5 上游引物（ F） 10 1 下游引物（ R） 10 1 探针（P） 10 1 模板 — 2 ddH2O — 补足至总体积为 25 检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。 8.2.3 反应条件 预变性： 95 ℃，3 min；变性： 95 ℃，15 s；延伸退火： 58 ℃，1 min，40个循环。在 58 ℃时 收集荧光信号值。 8.2.4 结果判定与表述 8.2.4.1 质量控制 质控对照应满足以下条件，否则应重新实验： a) 空白对照：无荧光对数增长，相应的 Ct值大于等于 40.0； b) 阴性对照：无荧光对数增长，相应的 Ct值大于等于 40.0； c) 阳性对