书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犆犆犛犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４１１８５ — ２０２１ 水生动物病原 犇犖犃 检测参考物质制备和质量控制规范 　 质粒 犛狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪犾犻狋狔犮狅狀狋狉狅犾狅犳狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾狊犳狅狉犇犖犃犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪狇狌犪狋犻犮犪狀犻犿犪犾狊狆犪狋犺狅犵犲狀 — 犘犾犪狊犿犻犱 　 ２０２１  １２  ３１ 发布 ２０２２  ０７  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。 本文件由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本文件起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 北京海关 、 连云港海关 。 本文件主要起草人 ： 林祥梅 、 张 、 王娜 、 吴绍强 、 景宏丽 、 谷强 、 任彤 、 周毅 、 江育林 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４１１８５ — ２０２１ 水生动物病原 犇犖犃 检测参考物质制备和质量控制规范 　 质粒 １ 　 范围 本文件给出了作为水生动物病原 ＤＮＡ 检测阳性参考物质的质粒 ， 其质量控制规范术语和定义 、 缩略语 、 原理 、 试剂或材料 、 仪器设备 ， 规定了质粒制备的通用要求 、 质粒的质量控制 、 质粒的验证 ， 以及质粒的质量评价方法 。 本文件适用于水生动物病原 ＤＮＡ 核酸检测中质粒的制备和质量控制 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＳＣ ／ Ｔ７０１９ 　 水生动物病原微生物实验室保存规范 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 变异系数 　 犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狅犳狏犪狉犻犪狋犻狅狀 概率分布离散程度的一个归一化量度 ， 其定义为数据标准差与数据平均值之比 。 ３ ． ２ 初始样 　 犳狉狅狀狋狊犪犿狆犾犲 按照制备先后顺序 ， 最先制备的 １ ／ ３ 批次产品 。 ３ ． ３ 均匀性 　 狌狀犻犳狅狉犿犻狋狔 同一生产批次的质粒 ， 每支含有等量目的基因的状态 。 ３ ． ４ 溯源性 　 狋狉犪犮犲犪犫犻犾犻狋狔 质粒中目的基因序列与病原参考毒株序列的一致性 。 ３ ． ５ 稳定性 　 狊狋犪犫犻犾犻狋狔 质粒在特定保存条件和保存时间范围内 ， 保证检测结果为阳性的能力 。 ３ ． ６ 阳性参考物质 　 狆狅狊犻狋犻狏犲狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾 与病原拥有某些完全相同的特征 ， 如相同的目的基因序列 、 抗原性 、 敏感性等 ， 用于该病原检测一定会得出理想的阳性检测结果 ， 通常作为阳性对照判定待测样品是否为病原阳性 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４１１８５ — ２０２１ ３ ． ７ 中间样 　 犿犻犱犱犾犲狊犪犿狆犾犲 按照制备先后顺序 ， 中间制备的 １ ／ ３ 批次产品 。 ３ ． ８ 终止样 　 犳犻狀犪犾狊犪犿狆犾犲 按照制备先后顺序 ， 最后制备的 １ ／ ３ 批次产品 。 ３ ． ９ 最小有效取样量 　 犿犻狀犻犿狌犿犲犳犳犲犮狋犻狏犲狊犪犿狆犾犲狏狅犾狌犿犲 使用病原检测方法 ， 可检测出阳性结果的最小阳性参考物质的量 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 Ａｍｐ ： 氨苄青霉素 （ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ） Ｃｔ ： 扩增循环数 （ ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ｄＡＴＰ ： 三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＣＴＰ ： 三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＧＴＰ ： 三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＮＴＰ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＴＴＰ ： 三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＥＢ ： 溴化乙锭 （ ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＩＰＴＧ ： 异丙基  β Ｄ 硫代半乳糖苷 （ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｂｅｔａＤｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ） ＬＢ ： 营养肉汤 （ ｌｕｒｉａｂｅｒｔａｎｉｂｒｏｔｈ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ｑＰＣＲ ： 实时荧光定量聚合酶链式反应 （ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） 犜犪狇 ： 水生嗜热菌 （ 犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊 ） ５ 　 原理 利用基因重组技术 ， 将目的 ＤＮＡ 片段连接入空质粒中 ， 再将连接产物转化入感受态细胞 ， 筛选出 含有阳性重组质粒的细胞 ， 再从细胞中提取质粒 ， 制备流程按照附录 Ａ 进行 。 为满足病原分子生物学 检测要求 ， 作为 ＤＮＡ 参考物质的质粒应具备以下特征 ： 包含有针对检测病原的目的 ＤＮＡ 片段 ； 不易降 解 ， 不会丢失病原 ＤＮＡ 片段 ； 易于大量制备提纯 ； 可用于病原定性或定量检测 。 ６ 　 试剂或材料 ６ ． １ 　 水 ： 符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水规定 。 ６ ． ２ 　 ＰＣＲ 试剂和 ｑＰＣＲ 试剂 ： 商品化试剂 。 ６ ． ３ 　 扩增病原目的基因的引物 ： 可参照相应的国家标准或行业标准合成 。 ６ ． ４ 　 琼脂糖 ： 电泳纯 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４１１８５ — ２０２１ ６ ． ５ 　 空质粒 ： 商品化试剂 。 ６ ． ６ 　 经高温高压灭菌处理的水 、 缓冲液 、 离心管 、 试管 、 ＰＣＲ 管 、 移液器枪头 、 培养皿 、 三角瓶 、 涂布棒或 棉签 。 ６ ． ７ 　 制备质粒所需的其他试剂 ： 按照附录 Ｂ 配制 。 ７ 　 仪器设备 ７ ． １ 　 超净工作台 。 ７ ． ２ 　 高速冷冻离心机 。 ７ ． ３ 　 电子天平 。 ７ ． ４ 　 高压灭菌锅 。 ７ ． ５ 　 ＰＣＲ 仪 。 ７ ． ６ 　 荧光定量 ＰＣＲ 仪 。 ７ ． ７ 　 电泳仪 。 ７ ． ８ 　 紫外分光光度计 。 ７ ． ９ 　 凝胶成像系统 。 ７ ． １０ 　 移液器 。 ８ 　 质粒制备的通用要求 ８ ． １ 　 目的 犇犖犃 的选择 目的 ＤＮＡ 片段应含有该病原检测方法中推荐的全部目的基因序列 。 ８ ． ２ 　 空质粒的选择 空质粒应具备以下特征 ： ａ ） 　 多克隆位点可以容纳全部目的基因片段 ； ｂ ） 　 性质稳定 ， 不易产生基因变异 ； ｃ ） 　 具备抗生素抗性基因或 犾犪犮犣 基因 ， 转化入感受态细胞后可进行抗性筛选或蓝白筛选 。 ８ ． ３ 　 连接反应 连接反应前 ， 目的 ＤＮＡ 片段和空质粒应提纯 。 ８ ． ４ 　 连接产物转化入感受态细胞 每批转化实验 ， 应设置未处理的感受态细胞作为空白对照 、 转化空质粒的感受态细胞作为阴性对 照 ， 转化已知重组质粒的感受态细胞作为阳性对照 。 只有在空白对照 、 阴性对照和阳性对照都成立的情 况下 ， 才能判定连接产物是否转化入感受态细胞 。 ８ ． ５ 　 质粒的纯度检测 使用紫外分光光度计测量质粒的 犃 ２６０ ／ 犃 ２８０ 比值 。 若比值介于 １．８ ～ ２．０ 之间 ， 则纯度合格 ； 否则需 重新提取 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ４１１８５ — ２０２１ ９ 　 质粒的质量控制 ９ ． １ 　 质粒的定性检测 ９ ． １ ． １ 　 犘犆犚 检测 以质粒溶液为模板 ， 同时设立阴性对照 （ 水 ） 和阳性对照 （ 病原 ＤＮＡ ）， 进行 ＰＣＲ 检测 ， 电泳观察检 测结果 ， 或使用质粒上的通用引物做 ＰＣＲ 检测 。 ９ ． １ ． ２ 　 目的基因的溯源性分析 对质粒多克隆位点进行测序 ， 测序结果与相应病原参考株的序列进行比对 。 ９ ． １ ． ３ 　 结果判定 在阴性对照和阳性对照都成立的情况下 ： ａ ） 　 可检测到目的 ＤＮＡ ， 且测序结果与相应病原参考株的序列同源性至少达到 ９９％ ， 则质粒可作 为阳性参考物质用于病原的定性分子生物学检测 ； ｂ ） 　 无明显的目的 ＤＮＡ ， 或测序结果与相应病原参考株的序列同源性低于 ９９％ ， 则说明病原目的 ＤＮＡ 并未正确插入质粒 ， 或质粒提纯失败 ， 需重新制备提纯 。 ９ ． ２ 　 质粒的定量检测 ９ ． ２ ． １ 　 狇犘犆犚 方法 以目的 ＤＮＡ 中的保守序列为模板 ， 设计引物和探针 。 分别以质粒和空质粒为模板进行 ｑＰＣＲ ， 对所设计的引物探针进行特异性检测 。 ａ ） 　 质粒检测结果为阳性 ， 空质粒为阴性 ， 则该套引物探针可以特异性扩增目的 ＤＮＡ ， 可用于目的 ＤＮＡ 的