ICS 65.020 CCS B 16 江 DB36 西 省 地 方 标 准 DB36/T 1652—2022 苦瓜抗枯萎病苗期鉴定技术规程 Technical specifications for resisitance evaluation of bitter gourd to Fusarium wilt at seedling stage 2022 - 09 - 26 发布 江西省市场监督管理局 2023 - 04 - 01 实施 发 布 DB36/T 1652—2022 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 接种体制备 ........................................................................ 1 5 鉴定方法 .......................................................................... 2 6 鉴定结果判断 ...................................................................... 2 7 鉴定品种要求 ...................................................................... 2 附录 A（资料性）苦瓜枯萎病菌生理小种 .................................................. 3 附录 B（规范性）枯萎病菌悬液的制备 .................................................... 5 附录 C（规范性）苦瓜品种枯萎病抗性鉴定表 .............................................. 6 I DB36/T 1652—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所、江西省高安市农业农村局。 本文件主要起草人：关峰、石博、张景云、万新建、张会国、黄国东、陈蕾、朱琦、陈保玲、蔡裕 山。 II DB36/T 1652—2022 苦瓜抗枯萎病苗期鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了苦瓜抗枯萎病苗期鉴定和抗性评价方法的术语和定义、接种体制备、鉴定方法、鉴定 结果判断、鉴定品种要求等。 本文件适用于苦瓜枯萎病苗期抗性鉴定及评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 16715.1 瓜类蔬菜作物种子 第1部分：瓜类 NY/T 2354 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 苦瓜 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 苦瓜枯萎病 bitter gourd Fusarium wilt 由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. momordica,FOM)所引起的叶片网状黄化，茎叶 坏死，切开病株可发现维管束变成褐色，致整株枯死的苦瓜土传病害。 4 接种体制备 4.1 病原物分离与保存 以常规组织分离法，从发病茎部的褐色维管束组织中分离枯萎病病原物，进行分离物的纯化，后经 形态学鉴定和致病性测定，确认为尖孢镰刀菌苦瓜专化型，保存备用。 4.2 生理小种鉴定 对于抗病性鉴定接种的病原分离物进行生理小种的鉴定，鉴定方法参照附录 A。 4.3 接种体 4.3.1 菌株繁殖 选择苦瓜枯萎病优势生理小种菌株制备接种体。将菌株活化后，用无菌水制成孢子悬浮液，均匀涂 1 DB36/T 1652—2022 抹在 PDA 平板上，置于 26 ℃下培养 5 d～7 d，待培养皿长满孢子。将枯萎病菌菌块，接种于装有灭菌 的 PS 培养基的三角瓶中，在摇床上 26℃条件下 160 r·min-1，恒温培养 3 d～5 d，即可产生大量分生孢 子，备用。 4.3.2 菌悬液制备 将 PS 培养基培养 3 d～5 d 的菌液用四层灭菌纱布过滤。过滤后的菌液离心（4000 r·min-1，5 min） ， 弃上清液。离心后的分生孢子液用无菌水稀释，用血球计数板计数分生孢子菌液浓度，使分生孢子悬浮 液接种浓度调至 106 cfu·mL-1。过滤后的菌丝用高速组织捣碎机捣碎，加至孢子悬浮液中混匀制成接种 菌悬浮液。 5 鉴定方法 5.1 播种育苗 播种前晒种 2 h～4 h，经次氯酸钠溶液浸泡 10 min，清水冲洗后，浸种 17 h，浸种期间搓洗种子 2～ 3 次，种子充分吸水后取出沥干，用湿纱布包好，保湿，至于 28℃～32℃培养箱内催芽，催芽期间每天 搓洗 1 次，防止种子发霉，发芽后播种至穴盘内，盖上小拱棚遮阳保湿。当有 70%～80%的幼苗出土后， 揭开小棚。幼苗应生长健壮、一致。每品种 3 次重复，每重复 15 株，共 45 株。 5.2 接种 当苦瓜幼苗长至两叶一心时接种，枯萎病悬浮液的制备见附录B。接种方法采用浸根移栽法接种， 浸根时间为30 min。 5.3 调查 接种后 9 d 进行病情调查。调查为各参鉴品种的全部重复，记载各品种的不同等级发病株数，计算 发病率及发病程度，并将品种抗性鉴定结果记入附录 C。病情分级标准参照 NY/T 2354。 DI=Σ ×100· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · （1） 式中： DI —病情指数； s —各病情级别的代表数值； n —各病情级别的植株数； N —调查总植株数； S —最高病情级别的代表数值。 6 鉴定结果判断 感病对照材料病情指数 DI≥50 时，该批次鉴定视为有效。 7 鉴定品种要求 2 DB36/T 1652—2022 提供鉴定的种子质量应符合GB/T 16715.1瓜菜作物种子瓜类要求，供鉴定的每个品种的种子数量不 少于150粒。 3 DB36/T 1652—2022 AA 附 录 A （资料性） 苦瓜枯萎病菌生理小种 A.1 学名和形态描述 A.1.1 学名 尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp. momordicae，FOM)。 A.1.2 形态描述 肉眼观察菌落形态，发现其菌丝致密絮状，白色至淡紫色。显微镜下观测其分生孢子，小型分生孢 子椭圆形，大小（7.5～12.6）μm×（2.4～3.6）μm；大型分生孢子呈镰刀形，多为 3～5 个隔膜，以 3 个隔膜的居多，大小（20.3～42.2）μm×2.2～4.1μm；产孢子细胞短，大小（5.9～25. 3）μm×（2.3～3.1） μm；厚垣孢子圆形至椭圆形，单生、顶生，直径 6.5μm ～10.8μm。 A.2 培养基的制备 A.2.1 PS培养基 马铃薯200 g，蔗糖20 g，蒸馏水1000 mL，121℃高压灭菌20 min。 A.2.2 PDA培养基 马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，121℃高压灭菌20 min。 A.3 生理小种鉴定 A.3.1 采用的鉴别寄主 鉴别寄主3个苦瓜品种LK0901、BK0604、赣4号。 A.3.2 生理小种鉴定 病原菌分离物接种鉴别寄主后，根据鉴别寄主病情级别计算其病情指数（DI）从而确定抗性反应， 以特定的反应组合划分生理小种（见表 A.1） 。 表A.1 苦瓜枯萎病菌生理小种 鉴别寄主 4 生理小种 Race 1 Race 2 Race 3 LK0901 HS HS S BK0604 HR HR HR 赣4号 R R R DB36/T 1652—2022 BB 附 录 B （规范性） 枯萎病菌悬液的制备 B.1 过滤菌丝 在 PS 培养基培养 3 d～5 d 后，培养基中含有大量枯萎病菌分生孢子和菌丝，用四层灭菌纱布过滤， 将菌丝用高速组织捣碎机捣碎备用。 B.2 离心 过滤后的菌液，离心（4000 r·min-1，5 min） ，弃上清液。 B.3 分生孢子数量检测及菌悬液的制备 离心后的分生孢子液用无菌水稀释，用血球计数板计数，使分生孢子悬浮液接种浓度调至 106 cfu·mL-1，将捣碎的菌丝加入混匀即为接种菌悬浮液。 5 DB36/T 1652—2022 CC 附 录 C （规范性） 苦瓜品种枯萎病抗性鉴定表 苦瓜品种枯萎病抗性鉴定表见表C.1、C.2、C.3。 表 C.1 苦瓜枯萎病抗病性分级表 病级 病情 0级 无症状 1级 1～2 片子叶明显变黄 2级 子叶发黄并萎蔫，维管束轻度变色 3级 子叶枯死，真叶发黄，维管束褐色 4级 全株萎蔫或枯死，维管束褐色 表 C.2 苦瓜枯萎病接种鉴定分级标准 抗性分级 病情指数 高抗 Highly resistant(HR) 0＜X≤15 抗 Resistant (R) 15＜X≤30 中抗 Moderately resistant (MR) 30＜X≤50 感 Susceptible (S) 50＜X≤70 高感 Highly susceptible (HS) 70＜X≤100 表 C.3 苦瓜品种枯萎病抗性鉴定调查记载表 品种编号 重复 病情分级 0 1 2 发病率 3 I II III I II III _______________