ICS 67.120.30 B 50 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 2094—2012 水产品中羟脯氨酸含量的测定 高效液相色谱法 Determination of Hydroxyproline in Fishery Products by High Performance Liquid Chromatography 2012 - 03 - 21 发布 2012 - 05-01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 2094 —2012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省海洋与渔业厅提出。 本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心。 本标准主要起草人：刘慧慧，张秀珍，徐英江，田秀慧，于召强，邓旭修。 DB37/T 2094 —2012 1 水产品中羟脯氨酸含量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了水产品中羟脯氨酸的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于水产品中羟脯氨酸含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 用盐酸于110 ℃水解试样，稀释、过滤水解产物，羟脯氨酸经 DABS-Cl 衍生后，用C18 柱分离，高 效液相色谱紫外检测器检测，外标法定量。 4 试剂 4.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 4.2 试剂主要包括： ——实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水标准； ——乙腈：色谱纯； ——盐酸； ——无水乙醇； ——N，N-二甲基甲酰胺； ——碳酸氢钠； ——氢氧化钠； ——柠檬酸：优级纯； ——磷酸二氢钠； ——二甲基氨基偶氮苯磺酰氯：DABS-Cl （4-Dimethylamin oazobenzene-4 '-sulfonyl chloride）， 纯度≥98﹪； ——羟脯氨酸标准品：L-羟脯氨酸（L-Hyp），纯度≥99﹪； ——羟脯氨酸标准储备溶液：准确称取羟脯氨酸标准品 0.1000g，用水溶解并定容至 100 mL。此溶 液浓度为 1.00g/L。4℃避光保存，有效期 1 个月； ——羟脯氨酸标准中间溶液：移取羟脯氨酸标准储备溶液，用水逐级稀释至 1.0mg/L。临用时配制； ——0.1mol/L 碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠 8.4g，用水溶解并稀释至 1 L； ——2 mol/L 氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠 80g，用水溶解并稀释至 1L； DB37/T 2094 —2012 2 ——0.1 m ol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸 21.0g，用900 mL 水溶解，加2 mol/L 氢氧化钠溶液 70mL， 用 2mol/L 氢氧化钠溶液滴定至 pH 6.4，用水定容至 1 L； ——12mmol/L 柠 檬酸溶液：量取 0.1mol/L 柠檬酸溶液 120mL，加 N，N-二甲基甲酰胺 40mL，用水 稀释至 1L； ——衍生试剂溶液：称取 DABS-Cl 0.013g ，用乙腈溶解并定容至 10mL，4℃避光保存，有效期 1 个月； ——衍生反应终止液：配制 50mmol/L 磷酸二氢钠溶液，用 2mo l/L 氢氧化钠溶液调至 pH 7.0，再 加等体积无水乙醇； ——6mol/L 盐 酸溶液：取盐酸 50mL，加水稀释并定容至 100mL。 5 仪器与设备 主要包括： ——高效液相色谱仪：配紫外检测器； ——天平：感量 0.01g； ——电子天平：感量 0.0001g； ——匀浆机； ——电热恒温干燥箱； ——恒温水浴； ——真空泵； ——酒精喷灯； ——微孔滤膜：0.45 µm； ——涡旋混合器。 6 试样制备 鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉，将肌肉、鳞、皮单独收集；虾，去头、去壳、去肠线，取肌肉部 分；蟹、贝、甲鱼、海参、海带等取可食部分，样品充分搅碎、混匀。如不能及时检测，-18℃以下冷冻保存备用。 7 测定步骤 7.1 水解 称取适量匀浆后的样品于水解管中，使每管中含蛋白质约20 mg，加入6mol/L盐酸6mL，充氮气1min， 抽真空至管内盐酸起泡，用火焰将管封口。于110℃水解22h，冷却后，将水解液全部转移到50mL容量瓶 中，加水至刻度。混匀后，根据样品中羟脯氨酸含量不同，分别取1mL～5mL水解液于10mL容量瓶中，加2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5～7.5，加水稀释至刻度。取1mL稀释液用0.45 μm滤膜过滤备用。 7.2 衍生 取过滤后的稀释液30 μL于1.5mL具塞离心管中，加0.1mol/L碳酸氢钠溶液30 μL，衍生试剂溶液 60μL，漩涡混匀30s，70℃水浴中衍生反应，2min时取出漩涡混匀1次，继续于70℃水浴中反应13min， 反应结束后取出迅速冷却，加入衍生反应终止液630 μL，用0.45 μm滤膜过滤，供高效液相色谱分析。