ICS 65.020.20 B 05 DB14 山 西 省 地 方 标 准 DB 14/ T 1506—2017 大豆皂苷测定方法 2017 - 12 - 10 发布 山西省质量技术监督局 2018 - 02 - 10 实施 发 布 DB14/ T 1506—2017 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 化学结构 .......................................................................... 1 5 测定原理 .......................................................................... 2 6 试剂 .............................................................................. 2 7 仪器设备 .......................................................................... 2 8 测定步骤 .......................................................................... 2 9 结果计算 .......................................................................... 3 10 重复性 ........................................................................... 4 I DB14/ T 1506—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山西农业大学提出并归口。 本标准起草单位：山西农业大学农学院。 本标准主要起草人：岳爱琴、杜维俊、赵晋忠、王敏、徐海军、张永坡、高春艳、郭东东、刁秀楠。 II DB14/ T 1506—2017 大豆皂苷测定方法 1 范围 本标准规定了大豆皂苷测定的术语和定义、化学结构、测定原理、试剂、仪器设备、测定步骤、计 算结果和重复性。 本标准适用于大豆种子、根、茎、叶以及种皮中大豆皂苷的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 22464 大豆皂苷 NY/T 1252 大豆异黄酮 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 大豆皂苷 大豆中的一类重要的次生代谢产物，是由大豆皂醇A和大豆皂醇B两种苷元和β -D-葡萄糖、β -D半乳糖、β -D-木糖、β -D-葡萄糖醛酸、α -L-鼠李糖、α -L-阿拉伯糖六种糖基及其乙酰化糖基等组成 的五环三萜齐墩果酸型皂苷。 4 化学结构 大豆皂苷根据结构不同将其分为A类、DDMP类、B类和E类皂苷，见表1。皂苷组分的化学结构见图1。 表1 大豆皂苷组成的种类 -R A类皂苷 DDMP类 B类 E类 A0-α g α g Ba Bd Ac A0-β g β g Bb Be Ae Af A0-γ g γ g Bb′ Be′ 4. β -D-葡萄糖基-(1→2)-O-α -L-阿拉伯糖 Ax Ad A0-α a α a Bx Bf 5. β -D-鼠李糖基-(1→2)-O-β -D-阿拉伯糖 Ay Az A0-β a β a Bc Bg 6. α -L-阿拉伯糖 Ag Ah A0-γ a γ a Bc Bg Aa系列 Ab系列 A0系列 1. β -D-葡萄糖基-(1→2)-O-β -D-半乳糖 Aa Ab 2.β -L-鼠李糖基-(1→2)-O-β -D-半乳糖 Au 3. β -D-半乳糖 1 DB14/ T 1506—2017 图1 皂苷组分的化学结构 5 测定原理 大豆皂苷溶液在波长205 nm处有最大吸收峰，在一定范围内，峰面积与大豆皂醇的浓度成正比关系。 6 试剂 6.1 试剂 6.1.1 超纯水，乙醇（分析纯），冰乙酸（分析纯），乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），冰乙酸（色 谱纯）。 6.1.2 提取液（含 0.01%乙酸的 70%乙醇溶液）：取 700 mL 无水乙醇加 0.1 mL 冰乙酸，然后加水稀释 至 1 000 mL。 6.2 标准品 6.2.1 大豆皂苷 Aa（98%）、大豆皂苷 Ab（98%）、大豆皂苷 Ba（98%）、大豆皂苷 Bb（98%）。 6.2.2 大豆皂苷标准液：准确称取大豆皂苷标准品 Aa、Ab、Ba、Bb 各 5 mg，置于 5 mL 容量瓶中，用 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。大豆皂苷标准品含量为 1 mg/mL。 7 仪器设备 所需仪器设备包括： a) 具有紫外检测器的高效液相色谱-质谱联用仪； b) 振动球磨仪； c) 感应量为 0.0001 g 的电子天平； d) 漩涡震荡仪； e) 台式离心机。 8 测定步骤 2 DB14/ T 1506—2017 8.1 提取 提取步骤如下： a) 将大豆各材料置于震荡研磨仪中，1 600 rpm 震荡 30 s，材料备用； b) 准确称取 0.100 g 样品，放入 10 mL 的离心管中，加入 5 mL 提取液（70%乙醇+0.01%乙酸）； c) 放入漩涡振荡器中，漩涡震荡 2 min，浸提 24 h； d) 室温下 3 000 r/min 离心 10 min；取上清液 2 mL，用 2 倍体积的正己烷萃取脱脂，用 0.22 μ m 滤膜过滤后密封保存备用。 8.2 高效液相色谱-电喷雾质谱联用仪分析条件 8.2.1 色谱柱：Hypersil Gold，150×2.1 mm，5 μ m；柱温为 30 ℃。 8.2.2 流动相比例见表 2，A 为含 0.025％冰乙酸的乙腈溶液，B 为含 0.025％冰乙酸的超纯水溶液。 表2 流动相比例 时间/t/min 0 15 20 25 30 35 40 A(%) 90 70 60 60 0 0 90 B(%) 10 30 40 40 100 100 10 8.2.3 流速：1.0 mL/min。 8.2.4 检测器：二极管阵列检测器，205 nm 波长。 8.2.5 进样体积：10 µL。 8.2.6 电喷雾质谱条件： ——质谱扫描：负离子扫描模式； ——扫描范围：400～1500； ——喷雾电压为：3.5 kV； ——鞘气的压力：30 psi； ——辅助气的压力：5 psi； ——毛细传输管温度：350 ℃。 8.3 色谱测定 在相同色谱条件下，分别将标准溶液和样品溶液注入高效液相色谱-质谱仪分析，运行完之后采用 选择性离子抽提模式抽提大豆皂苷各组分的离子色谱图，以质荷比定性，根据4个标准品的标准曲线以 峰面积进行定量。 9 结果计算 9.1 A 系列皂苷单体组分的计算 A系列皂苷单体组分的计算，见公式（1）。 3 DB14/ T 1506—2017 式中： Xi——样品中大豆皂苷组分的含量（ug/g）； Xa——大豆皂苷标准品Aa的含量（ug/mL）； Ma——大豆皂苷标准品Aa的峰面积； V——样品总体积，单位为微升（mL）； M——样品质量，单位为克（g）。 计算结果保留三位有效数字。 9.2 B 系列、DDMP 系列和 E 系列皂苷单体组分的计算 B系列、DDMP系列和E系列皂苷单体组分的计算，见公式（2）。 Xi——样品中大豆皂苷组分的含量（ug/g）； Xa——大豆皂苷标准品Ba的含量（ug/mL）； Ma——大豆皂苷标准品Ba的峰面积； V——样品总体积，单位为微升（mL）； m——样品质量，单位为克（g）。 计算结果保留三位有效数字。 10 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。 _________________________________ 4