ICS 65.020 CCS B 16 13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5457—2021 马铃薯对黄萎病抗性评价技术规程 2021 - 12 - 13 发布 2022 - 01 - 13 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 5457—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。 本文件起草单位：河北省农林科学院植物保护研究所。 本文件主要起草人：鹿秀云、李社增、年冠臻、郭庆港、张晓云、赵卫松、苏振贺、马平。 I DB 13/T 5457—2021 马铃薯对黄萎病抗性评价技术规程 1 范围 本文件规定了马铃薯对黄萎病（Verticillium wilt）抗性的室内评价和田间评价的方法及程序。 本文件适用于马铃薯品种和材料抗黄萎病的评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 感病对照品种 referenced susceptible variety 罹病后黄萎病病情指数能达40.0以上的品种。 病情指数 disease index 全面考核供试品种发病率和严重程度的综合指标。 病情指数校正系数 correction of the disease index 标准病情指数（50.0）与同批次评价试验中感病对照品种病情指数的比值，记作K。 相对病情指数 relative disease index 病情指数与病情指数校正系数的乘积，记作RDI。 4 仪器设备 恒温摇床、恒温培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、冰箱、显微镜、甩干机、可控温的温室及培 养室（使温度保持在20 ℃～28 ℃）、不锈钢锅、电磁炉、培养皿、试管、剪子、镊子、三角瓶等。 5 室内评价 病原菌的选择、培养和接种液制备 选择马铃薯黄萎菌强致病力菌株，在马铃薯琼脂培养基（PDA）上活化7 d～10 d，挑取菌落边缘 的新鲜菌丝块4～5块转接于马铃薯葡萄糖培养液（PDB，150 mL/300 mL三角瓶）中，在25 ℃、180 rmin1条件下恒温振荡培养5 d后用2层灭菌纱布滤除菌丝，得到分生孢子悬浮液。在显微镜下用血球计数 板计数，并用灭菌水将其浓度调整为1.0×107孢子/mL，作为接种液。 感病对照品种选择 选择对黄萎病表现高度感病的马铃薯品种费乌瑞它作感病对照品种。 1 DB 13/T 5457—2021 马铃薯种薯处理与育苗 将供试马铃薯品种及感病对照品种的种薯置于25 ℃催芽15 d左右，待芽长至0.5 cm后，用75%酒 精消毒刀具，自尾芽开始切成立体小三角块（25 g～50 g），保证每块至少有1～2个芽眼。25 ℃摊开 放置4 h，待薯块切口风干后播种于薄壁塑料育苗盆。育苗盆口径为20 cm，下部垫灭菌土（大田土壤 重量:育苗基质重量=1:1，121 ℃，0.1 MPa～0.15 MPa，1 h）5 cm～6 cm，压实，每盆放置3块薯块， 上部覆土厚度为3 cm～4 cm，灌足自来水，在温室中培养（培养温度为20 ℃～28 ℃，出苗后10 h光照， 14 h黑暗。阴天开补光灯，光照过强使用遮阳网）。每个品种播种5盆作为1次重复，重复4次。 病原菌接种 采用人工伤根接种法。待马铃薯出苗后15 d，用消毒的壁纸刀将花盆底部切掉，再用壁纸刀沿 花盆底部平切伤根，然后放到底部铺有2 cm灭菌土的同样新花盆中，置于接种液（2.0 L）中浸泡30 min，继续在原来环境中培养。设置清水处理为对照。 6 6 田间评价 选地 人工黄萎病圃应建立在马铃薯代表性产区或土壤气候条件相似、有利于黄萎病发生的地区；要 求发病均匀，正常年份感病对照品种的病情指数达到40.0～60.0；病圃地势平坦，排灌方便，周围 无房屋、树木等荫蔽，有隔离设施。 病原菌培养基质的准备 选用带短绒的棉花毛籽作为繁殖病原菌的营养基质。首先将棉花毛籽放入容器中，加入自来水 （洗涤灵浓度0.1%）将棉籽浸没，浸泡过夜；次日将棉籽装入纱袋中并用甩干机甩干，然后装入菌 种繁殖袋中（每袋3.0 kg），用棉塞和报纸封口，高压湿热灭菌1 h（121 ℃，0.1 MPa～0.15 MPa）备 用。 病原菌的繁殖 接种液培养方法同5.1。每袋培养基质接种500 mL接种液后扎紧袋口并摇匀，25 ℃恒温静置培养 15 d～20 d，即可用于田间接种。 人工病圃建立 -1 将培养好的接种物用搅拌机或铁锨搅拌均匀至单粒棉籽基本分开状态，按照1500 kgha 均匀撒 于地表，随即浅层（约20 cm）旋耕，使接种物与土壤混合均匀。 感病对照品种选择 选择对黄萎病表现高度感病的马铃薯品种费乌瑞它作感病对照品种。 马铃薯播种 按照当地种植方式播种马铃薯于人工病圃中，每个品种重复3～4次，每个重复至少20株。 7 病情调查记载 监测感病对照品种的发病情况，当感病对照品种病情指数达到50.010.0时，调查并记录本批次 评价试验中所有供试品种的病情严重度。 病情严重度分成五个级别，病级值分别为0，1，2，3和4。各病级症状描述如下： 0级：健株，叶片无症状； 1级：病株显症叶片数占总叶片数的比例≤25%，叶肉变为淡黄色或呈不规则形的黄色病斑； 2级：25%＜病株显症叶片数占总叶片数的比例≤50%，叶部褪绿形成病斑，病斑颜色大部分为 黄色或黄褐色，叶片边缘略有卷枯； 3级：50%＜病株显症叶片数占总叶片数的比例≤75%，有少数叶片凋落； 2 DB 13/T 5457—2021 4级：病株显症叶片数占总叶片数的比例＞75%，多为褐色枯斑，有的病株叶片脱落成光杆，整 株枯死。 8 结果计算 病情指数（DI）（计算结果精确到小数点后 1 位） DI =∑（病级值×相应株数）/（最高病级值×总株数）×100…………（1） 相对病情指数（RDI） 感病对照品种病情指数在40.0～60.0之间可采用相对病情指数，超出范围则不宜采用。 校正系数K（计算结果保留小数点后3位）： K = 50.0/本批次评价中感病对照品种的病情指数……………………（2） 相对病情指数（RDI）（计算结果保留小数点后1位）： RDI = K×供试品种病情指数…………………………………（3） 9 抗性评价 根据被评价马铃薯品种的相对病情指数（RDI）的大小评定该品种的抗病性类型。抗病性类型的 划分标准见表1。 表 1 马铃薯品种抗病性类型的划分标准 序号 抗病性类型 相对病情指数范围 1 免疫（I） RDI=0.0 2 高抗（HR） 0.0＜RDI≤10.0 3 抗病（R） 10.0＜RDI≤20.0 4 耐病（T） 20.0＜RDI≤35.0 5 感病（S） RDI＞35.0 3 DB 13/T 5457—2021 A A 附 录 A （资料性） 马铃薯黄萎病病原及症状 A.1 病原菌的分类地位 大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota）， 粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座目（Hypocreales），轮枝菌属（Verticillium），大丽轮枝菌 种（V. dahliae Kleb.）。 A.2 培养特性和孢子形态 初生菌丝体无色，后变褐色，有分隔，直径2.0 µm～4.0 µm。菌丝体常呈膨胀状，可单根或数根 菌丝形成微菌核。 分生孢子呈椭圆形，单细胞，大小为（4.0 µm～11.0 µm）×（1.7 µm～4.2 µm），由分生孢子 梗上的瓶梗末端逐个割裂。空气干燥时，孢子在瓶梗末端聚集成堆，空气湿润时，则形成孢子球。 显微镜下制片观察时，孢子即散开，只留下梗端新生出的单个孢子。 分生孢子梗常由2～4个轮生瓶梗及上部的顶枝构成，基部略膨大、透明，每轮层有瓶梗1～7根， 通常有3～5根，瓶梗长度为13.0 µm～18.0 µm，轮层间的距离为30.0 µm～38.0 µm。 A.3 症状 盆栽马铃薯苗期黄萎病发病症状：下部叶片先表现症状，叶片或叶片主脉间叶肉表现淡黄色不 规则病斑，叶肉组织变软，后病斑颜色大部分变成黄色和黄褐色，叶片边缘有卷枯，少数叶片凋落， 后期叶片全部显病状、萎蔫或枯死。 田间马铃薯黄萎病症状：下部叶片先表现出症状，发病初期从叶尖到叶缘逐渐萎蔫，褪绿变黄， 叶肉组织变软，后变褐干枯，不脱落。 4 DB 13/T 5457—2021 B B 附 录 B （规范性） 病情调查表 B.1 病情调查表 评价地点： 评价时间： 年 月 日 第 次调查 各级病株数 品种名称 调查总株数 0级 调查人： 1级 2级 3级 校核人： 年 月 日 年 病情指数 4级 审核人： 月 日 年 月 日 5 DB 13/T 5457—2021 C C 附 录 C （规范性） 评价结果报告表 C.1 评价结果报告表 送样单位： 品种名称 相对病情指数 鉴定单位（盖章）：技术负责人： 年 6 月 日 抗病性类型