ICS 65.020 CCS B 16 13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5458—2021 重要作物病原大丽轮枝菌致病力评价 技术规程 2021 - 12 - 13 发布 2022 - 01 - 13 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 5458—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。 本文件起草单位：河北省农林科学院植物保护研究所。 本文件主要起草人：李社增、鹿秀云、杜立新、郭庆港、张晓云、赵卫松、苏振贺、马平。 I DB 13/T 5458—2021 重要作物病原大丽轮枝菌致病力评价 技术规程 1 范围 本文件规定了重要作物病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）的致病力评价方法 和程序。 本文件适用于来源于不同寄主的大丽轮枝菌在棉花、茄子、马铃薯和向日葵等作物上的致病力 评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 本文件没有规范型引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 致病力 pathogenicity 是指病原菌所具有的破坏寄主和引起病变的能力。 鉴定寄主 differential host 本文件中是指对病原菌表现感病的指定作物品种。 对照病原菌菌株 referenced pathogenic isolate 在鉴定寄主上表现强致病力（病情指数40.0）的大丽轮枝菌菌株。 病情指数 disease index 全面考核鉴定寄主发病率和严重程度的综合指标。 病情指数校正系数 correction coefficient of disease index 标准病情指数（50.0）与同批次评价试验中对照病原菌菌株在鉴定寄主上病情指数的比值，记 作K。 相对病情指数 relative disease index 病情指数与病情指数校正系数的乘积，记作RDI。 4 仪器设备 1 DB 13/T 5458—2021 恒温摇床、恒温培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、冰箱、显微镜、可控温的温室及培养室（使 温度保持在20 ℃～28 ℃）、不锈钢锅、电磁炉、培养皿、试管、剪子、镊子、广口瓶、酒精灯等。 5 评价前准备 对照病原菌菌株选择 选择对照病原菌菌株为大丽轮枝菌WX-1，落叶型，在棉花、茄子、马铃薯和向日葵四种作物的 感病品种上均表现强致病力，在相应鉴定寄主上的病情指数均能稳定达到40.0以上。 接种液准备 在超净工作台上，将分离纯化的大丽轮枝菌菌株及对照病原菌菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂培 养基（PDA）平板上进行活化，25 ℃恒温培养7 d，挑取菌落边缘的新鲜菌丝块（直径5 mm）4～5块转 -1 接于马铃薯葡萄糖培养液（PDB）中，25 ℃、180 rmin 条件下恒温震荡培养5 d，培养液用2层灭菌 纱布滤除菌丝得到分生孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板计数滤液中分生孢子数量，并用灭菌 7 水将其浓度调整为1.0×10 孢子/mL，此为接种液。 鉴定寄主选择 选择对照病原菌菌株接种后表现高度感病的棉花品种鄂荆1号、茄子品种海23号、马铃薯品种费 乌瑞它和向日葵品种LD5009作为鉴定寄主。鉴定寄主种子要求在无病地繁殖。 6 评价程序 鉴定寄主育苗 6.1.1 马铃薯育苗 将鉴定寄主种薯放置于25 ℃催芽15 d左右，待芽长至0.5 cm后，用75%酒精消毒刀具，自尾芽开 始切成立体小三角块（25 g～50 g），保证每块至少有1～2个芽眼。25 ℃摊开放置4 h，待薯块切口 风干后开始播种于薄壁塑料育苗盆。育苗盆口径为20 cm，下部垫灭菌土（大田土壤重量:育苗基质重 量=1:1，121 ℃，0.1 MPa～0.15 MPa，1 h）5 cm～6 cm，压实，每盆3块薯块，上部覆土厚度为3 cm～ 4 cm，灌足自来水，在温室中培养（培养温度为20 ℃～28 ℃，出苗后10 h光照，14 h黑暗。阴天开 补光灯，光照过强使用遮阳网）。每个供试大丽轮枝菌菌株致病力评价试验4次重复，每5盆为1次重 复。 6.1.2 棉花、茄子和向日葵育苗 将各鉴定寄主的种子用1%次氯酸钠浸泡10 min进行表面消毒后，清水冲洗3次，置于55 ℃水中浸 泡30 min后取出，用湿纱布包裹种子，置于30 ℃保湿培养，待种子露白（芽长2 mm以上）后种植于4 ×8孔书式育苗盒中，下部铺垫灭菌土（大田土壤重量:育苗基质重量=1:1，121 ℃，0.1 MPa～0.15 MPa，1 h））9 cm，压实，每孔3粒种子，上部覆土厚度为2 cm，浇足水后在温室中培养（培养温度为 20 ℃～28 ℃，出苗后10 h光照，14 h黑暗。阴天需开补光灯，光照过强需放遮阳网）。每个作物品种 播种16孔为1次重复，每个供试大丽轮枝菌菌株致病力评价试验4次重复。 病原菌接种 6.2.1 马铃薯接种 待马铃薯出苗后15 d，用消毒的壁纸刀将花盆底部切掉，再用壁纸刀沿花盆底部平切伤根，放到 底部铺有2 cm灭菌土的同样新花盆中，在接种液（2.0 L）中浸泡30 min，继续在原来环境中培养。 每批次评价试验中均设对照病原菌菌株处理和清水对照处理。 6.2.2 棉花、茄子、向日葵接种 2 DB 13/T 5458—2021 待棉花、茄子、向日葵长至2片真叶时，打开书式育苗盒，在距离作物根尖2 cm处用消毒剪刀将 根剪断，制造伤口，关闭育苗盒，将带有伤口的植株在接种液（2 L/育苗盒）中浸泡30 min后，继 续在原来环境中培养。每批次评价试验中均设对照病原菌菌株处理和清水对照处理。 病情的调查记载 各鉴定寄主接种病原菌后，实时监测对照病原菌菌株处理的发病情况，当对照病原菌菌株处理 的病情指数达到50.010.0时，调查并记录本批次评价试验中所有供试菌株处理的病情严重度。 病情严重度分成五个病级，病级值分别为0，1，2，3和4。各病级症状描述如下： 0级：健株，叶片无症状； 1级：病株显症叶片数占总叶片数的比值≤25%，叶肉变为淡黄色或呈不规则形的黄色病斑； 2级：25%＜病株显症叶片数占总叶片数的比值≤50%，病斑颜色大部分变成黄色或黄褐色，叶片 边缘略有卷枯； 3级：50%＜病株显症叶片数占总叶片数的比值≤75%，有少数叶片凋落； 4级：病株显症叶片数占总叶片数的比值＞75%，多为褐色枯斑，叶片有的脱落成光杆，整株枯 死。 7 结果计算 病情指数（DI）（计算结果精确到小数点后 1 位） DI = ∑（病级值×相应病株数）/（最高病级值×总株数）×100 相对病情指数（RDI） 对照病原菌菌株处理的病情指数在40.0～60.0之间可采用相对病情指数，超出范围则不宜采用。 校正系数 K（计算结果保留小数点后 3 位） ： K = 50.0/本批次评价中对照病原菌菌株处理的病情指数； 相对病情指数（RDI）（计算结果保留小数点后1位）： RDI = K×供试菌株处理的病情指数 8 致病力评价 根据被评价的大丽轮枝菌菌株在鉴定寄主上的相对病情指数（RDI）的大小，确定该供试菌株在 相应作物上的致病力级别。致病力级别的划分标准见表1。 表 1 大丽轮枝菌菌株致病力级别划分标准 序号 相对病情指数范围 致病力级别 1 0 无 2 0.1～25.0 弱 3 25.1～50.0 中 4 50.1～100.0 强 3 DB 13/T 5458—2021 A A 附 录 A （资料性） 大丽轮枝菌及其引起的黄萎病症状 A.1 病原菌的分类地位 大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota）， 粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座目（Hypocreales），轮枝菌属（Verticillium），大丽轮枝菌 种（V. dahliae Kleb.）。 A.2 培养特性和孢子形态 初生菌丝体无色，后变褐色，有分隔，直径2.0 µm～4.0 µm。菌丝体常呈膨胀状，可单根或数 根菌丝形成微菌核。 分生孢子呈椭圆形，单细胞，大小为（4.0 µm～11.0 µm）×（1.7 µm～4.2 µm），由分生孢子 梗上的瓶梗末端逐个割裂。空气干燥时，孢子在瓶梗末端聚集成堆，空气湿润时，则形成孢子球。 显微镜下制片观察时，孢子即散开，只留下梗端新生出的单个孢子。 分生孢子梗常由2～4个轮生瓶梗及上部的顶枝构成，基部略膨大、透明，每轮层有瓶梗1～7根， 通常有3～5根，瓶梗长度为13.0 µm～18.0 µm，轮层间的距离为30.0 µm～38.0 µm。 A.3 温室内黄萎病症状 温室马铃薯苗期黄萎病发病症状：下部叶片先表现出症状，叶片或叶片主脉间叶肉表现淡黄色 不规则病斑，随后病斑颜色大部分变黄色和黄褐色，叶肉组织变软，叶片边缘有卷枯，有少数叶片 凋落，后期叶片全部显病状、萎蔫或枯死。 温室棉花、茄子、向日葵苗期黄萎病发病症状：植株子叶或下部真叶叶缘或叶脉间出现浅黄色 斑块。后逐渐扩展，叶色失绿变黄褐色，病叶出现掌状斑驳，叶肉变厚，叶缘向下卷曲，发生严重 时，整张叶片枯焦破碎，叶片由下而上逐渐脱落，仅剩顶部少数小叶，发生严重时植株光杆。 4 DB 13/T 5458—2021 B B 附 录 B （规范性） 病情调查表 表B.1 病情调查表 评价地点： 鉴定寄主（品种）： 评价时间： 年 月 日 第 次调查 各级病株数 菌株编号 调查总株数 0级 调查人： 年 1级 2级 3级 校审人： 月 日 年 病情指数 4级 审核人： 月 日 年 月 日 5 DB 13/T 5458—2021 C C 附 录 C （规范性） 评价结果报告表 表C.1 大丽轮枝菌在 植物上致病力评价报告表 送样单位： 菌株编号 评价单位（盖章）： 相对病情指数 致病力级别 技术负责人： 年 6 月 日